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論文ID

原名：Molecular and biochemical components associated with chilling tolerance in tomato: comparison of diferent developmental stages

實驗設計

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結果

1 ? 耐寒和對寒冷敏感的RIL果實中基因的差異表達

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為了對果實對CS的反應進行轉錄組分析，研究者納入了3個耐寒RIL（47號、65號、99號）和3個對寒冷敏感RIL（71號、135號、150號），這是在研究者之前的研究中確定的。對于這項分析，研究者嚴格要求在所有3個耐寒RIL和所有3個冷敏感RIL中都能觀察到測得的差異表達（DE），這樣就能確定在應用CS后在兩個類別之間顯著表達的差異基因（圖S1）。主成分分析（PCA）顯示，在所有6個RIL中，24小時CS處理與2小時CS或對照處理之間的基因表達量（GE）存在顯著差異，表明大部分DE發生在暴露于CS24小時之后（圖S2）。此外，PCA顯示，暴露于CS24小時后，兩類RIL之間的GE存在顯著差異（圖S2）。

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在CS之前，兩類RIL中7個基因的表達量存在顯著差異（2倍，FDR＜0.05），其中4個基因在耐寒類RIL中表達量較高（其中2個基因與參與非生物脅迫感知，與信號轉導的受體激酶存在同源性（見討論）），3個基因在冷敏感RIL中表達量較高（與具有脅迫防御功能的蛋白質存在同源性）（圖1A和補充表S2）。暴露于CS2小時后，10個基因在耐寒RIL和冷敏感RIL中有不同程度的表達，其中4個基因在耐寒RIL中的表達量顯著上調，6個基因在冷敏感RIL中的表達量顯著上調（圖1B和補充表S3）；下文將討論這些基因及其編碼蛋白的可能功能。暴露于CS處理24小時后，共有486個基因在耐寒RIL和冷敏感RIL中表現出顯著差異（2倍，FDR＜0.05）（補充表S4），其中385個基因在冷敏感RIL中的GE顯著高于在耐寒RIL中的GE，101個基因在冷敏感RIL中的GE顯著低于在耐寒RIL中的GE（圖1C和補充表S4）。研究者利用基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）通路進行的富集分析表明，24h?DEGs組（486個基因）富集了8個GO術語，包括生物過程（BP）鈣介導的信號轉導和分子功能（MF）鈣離子結合。兩個KEGG富集途徑是苯丙氨酸代謝和植物-病原體相互作用（圖1D）。

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除Solyc05g013320和Solyc02g072440外，大多數與鈣介導的信號轉導相關的DEGs在冷敏感RILs中上調，它們分別與蛋白激酶和受體樣蛋白激酶同源，在冷耐受RILs中上調（圖1E和補充表S5）。

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圖1.敏感（5，135，150）和耐受（47，65，99）RIL果實對冷脅迫響應的轉錄組學概述。A）熱圖顯示冷脅迫前敏感RIL和耐受RIL中差異調控基因（DEGs）的表達情況。B）熱圖顯示暴露兩小時后敏感RIL和耐受RIL中DEGs的表達情況。C）熱圖顯示暴露于冷脅迫24小時后，敏感RIL和耐受RIL中486個DEGs的表達情況。D）使用KOBAS對番茄果實暴露于冷脅迫24小時后的486個DEGs進行基因本體（GO）富集分析。E）展示了486個DEGs中與鈣介導的信號轉導相關的21個高表達基因。在熱圖中，深紅色表示高表達，天藍色表示低表達。S，冷敏感RILs；T，冷耐受RILs。使用DESeq2R軟件包進行DEGs分析（兩倍，FDR＜0.05）

2 ? 果實在采后貯藏期間對寒冷脅迫的轉錄組反應

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除了耐寒類（3個RILs）與冷敏感類（3個RILs）對CS的反應方向不同的基因外，研究者還發現了2454個基因在兩類中以相同的方式差異表達（2倍，FDR＜0.05）（補充表S6）。研究者進行了GO注釋分析，以闡明這些基因的潛在功能。這些轉錄本的生物過程（BP）一般富集項包括對一般刺激的響應，包括對冷和熱等非生物脅迫的響應（圖2A）。分子功能（MF）富集的GO術語包括轉移酶活性、DNA結合、轉錄調節因子活性、DNA結合轉錄因子活性、裂解酶活性和碳-碳裂解酶活性（圖2A）。細胞組分（CC）富集的GO術語僅包括細胞核（圖2A）。KEGG通路分析表明，CS對一般代謝通路和晝夜節律與光合作用有顯著影響，其中天線蛋白術語的富集程度最高（圖2A）。分析結果表明，在CS處理24小時后，與熱脅迫反應相關的大多數基因在兩個類別中都出現了下調，而3個熱脅迫轉錄因子基因則出現了上調（圖2B和補充表S7）。為了鑒定暴露于CS后具有相同DE模式的基因，研究者對2454個DEGs進行了聚類分析，生成的8個K-means聚類中，有4個聚類（2、4、5和8）包含了暴露于CS后在所有6個RIL中具有明確且相似調控模式的基因（圖2和補充表S6）。研究者對所包含的基因進行了GO分析，以確定每個聚類所代表的關鍵生物過程。結果顯示，由621個基因組成的聚類2的基因在暴露于CS處理后表現出逐漸誘導GE，在暴露于CS24小時后達到最大水平（圖2C）。研究者對聚類2基因的GO分析顯示了2個BP術語：對刺激的反應和生物調控。研究者共發現8個中MF，其中3個可能與基因表達調控有關，3個表示糖分子的轉移。KEGG通路分析顯示，晝夜節律以及淀粉和蔗糖代謝通路這兩個術語富集（圖2D）。研究者進一步調查BP對刺激的反應所包含的基因，發現了可能參與CS反應的調控基因（圖2E和補充表S8）。聚類4包括198個基因，這些基因的表達量在暴露于CS2小時后出現短暫下降，而在暴露于CS24小時后又出現上升（圖2F）。聚類4的GO分析確定了2個BP術語的富集，即碳氫化合物分解和對脫落酸的反應（圖2G）。KEGG通路分析顯示植物激素信號轉導富集（圖2G）。聚類5包括270個基因，其表達在暴露于CS2小時后表現出短暫的誘導，然后在暴露于CS24小時后降至原來的水平（圖2H）。研究者對該簇的GO分析發現了5個BP術語，其中主要富集了對熱的反應、蛋白質折疊和對非生物刺激的反應（圖2I）。在MF中，發現了2個術語，其中熱休克蛋白結合被高度富集（圖2I）。KEGG通路分析顯示有8個通路顯著富集，其中主要富集的是光合作用-天線蛋白（圖2I）。與對照組相比，暴露于CS2小時后，BP術語“蛋白質折疊”中的Hsps基因普遍上調（圖2J和補充表S9）。聚類8包括275個基因，在暴露于CS2小時后，這些基因的表達量減少，而在暴露于CS24小時后，這些基因的表達量仍然很低（圖2K）。研究者對聚類8基因的GO分析顯示了2個BP項，其中葉綠素分解過程的富集程度很高（圖2L）。KEGG通路分析表明，晝夜節律、色氨酸代謝、卟啉和葉綠素代謝過程富集（圖2L）。

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圖2.所有六種RIL果實在暴露于1.5℃溫度24小時后的共同轉錄組反應。對所有六個RIL果實中識別出的2454個冷響應DEGs進行了生物信息學分析。A）顯示所有六個RIL冷敏感（5、135和150）和冷耐受（47、65和99）的2454個DEGs常見表達功能注釋的GO分類和KEGG分類的氣泡圖。B）熱圖分析顯示了BP術語“對熱的反應”中包含的基因的共同反應。C）聚類2包含的621個DEGs的表達模式。D）顯示功能注釋的DEGs的GO分類和KEGG類別分類的氣泡圖，這些DEGs通常在聚類2中表達和分組。E）熱圖分析顯示聚類2中GO術語“對刺激的反應”所包含基因的共同反應。F）聚類4包含的198個DEG的表達模式。G）顯示聚類4中常見表達和分組的功能注釋DEG的GO分類和KEGG類別分類的氣泡圖。H）聚類5包含的270個DEGs的表達模式。I）顯示聚類5中常見表達和分組的功能注釋DEG的GO分類和KEGG類別分類的氣泡圖。J）熱圖分析顯示了聚類5中包含在GO術語--蛋白質折疊中的基因的共同響應。K）聚類8包含的275個DEG的表達模式。L）顯示聚類8中常見表達和分組的功能注釋DEG的GO分類和KEGG類別分類的氣泡圖。在熱圖中，深紅色表示上調的DEGs，天藍色表示下調的DEGs。使用KOBAS和PANTHER對2454個基因進行了GO富集分析。使用DESeq2R軟件包進行DEGs分析（兩倍，FDR＜0.05）。

3 ? 果實和植株組織對寒冷脅迫反應的相關性

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研究者將珍珠巖栽培的幼苗（實驗1）從1.5℃的3天生長溫度移至最適溫度時，3個耐寒RIL（之前根據其采后果實確定為耐寒品系）很快恢復并繼續正常生長，而3個對寒冷敏感的RIL則倒伏（圖3A和B）。同樣，對于土壤種植的植株（實驗2），當幼苗從1.5℃移至最適溫度時，4個耐寒RIL（47、49、65和99）在最適溫度下恢復10天后的存活率遠遠高于4個對寒冷敏感的RIL（5、71、90和150）（圖3C和D；補充數據圖S3A和B）。在后一項實驗中，敏感RIL71和90的所有葉片都變褐、干枯和起皺，而敏感RIL5和150雖然所有葉片都有損傷，但主要是下部葉片干枯和起皺（圖3C和D；補充數據圖S3A）。相比之下，4個耐寒RIL（47、49、65和99）很好地經受住了CS的考驗，它們的大部分葉片在轉到最佳條件后都表現出良好的恢復能力（圖3D；補充數據圖S3B）。此外，在MS平板上培育的10d幼苗實驗（實驗3）中，耐受性和敏感性RIL之間存在顯著差異。研究者將幼苗從CS處理移至正常溫度后，耐受性RIL仍保持綠色并能存活，而敏感性RIL則出現黃化，存活率降低（圖3E和F）。與敏感RIL相比，耐受性RIL47、49、65和99的葉綠素水平顯著更高，這說明它們對CS的耐受能力更強（圖3G）。

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圖3.不同番茄RIL植物組織對冷脅迫的敏感性。A，B）冷敏感（71、135、150）和冷耐受（47、65和99）RIL在珍珠巖中生長，幼苗（約30天大；約20-30cm高）在1.5℃光照下培養3天。E，F）冷敏感（5、71、90、150）和冷耐受（47、49、65、99）RIL在沙土（C、D）或MS平板（~10天大；~8-10cm高）中生長，幼株在1.5℃下培養24小時，然后在25℃下恢復生長10天。G）MS生長植株低溫恢復10天后的總葉綠素含量。不同字母的橫杠表示敏感品系和耐受品系之間的顯著差異。單因素方差分析p≤0.05,由Turkey-Kramer HSD確定。

4 ? 耐寒和對寒冷敏感的RIL葉片對寒冷脅迫的生理和生化反應

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植物暴露于CS后的初步目測評估表明，“耐寒”和“冷敏感”RIL之間存在顯著差異。研究者發現，4個敏感RIL的葉片比4個耐寒RIL的葉片脫水和卷曲程度更高（圖4A和B），敏感RIL的CI指數顯著更高（圖4C）。研究者通過測量與冷害相關的各種生理生化參數，進一步研究了兩類植物之間的差異。結果顯示，冷敏感RIL葉片的電解質滲漏值顯著高于冷耐受RIL葉片，約為后者的兩倍（圖4D和補充數據圖S4A）。冷敏感RIL的葉片中H2O2含量顯著高于冷耐受RIL的葉片（圖4E）。冷敏感RIL的丙二醛（MDA；脂質過氧化產物）含量高于冷耐受RIL（圖4F和補充圖S4B）。此外，與耐寒RIL相比，MS培育的10天幼苗（實驗3）也表現出視覺差異（圖3E和F）和生理差異（圖4G和H）。耐寒RIL150與耐寒RIL47和99之間的差異在統計學上并不顯著（圖4G）。在土壤種植的植株中，敏感RIL的MDA含量高于耐受RIL（圖4H）。

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圖4.不同番茄RIL葉片上指示冷害發展的生理生化指標。在土壤中生長的植株（約30天）中測量了不同的參數，包括冷敏感（5、71、90、150）或冷耐受（47、49、65、99）RILs。A-C）冷處理對葉片損傷指數的影響。D）電解質滲漏指數。E）H2O2含量。F） MDA含量。此外，（G）離子滲漏指數和（H）MDA含量是在冷脅迫后MS生長的幼苗（約10天大）中測量的。數據為平均值±SE，n=4；生物重復。不同的小寫字母表示敏感品系和耐受品系之間的顯著差異。單因素方差分析p≤0.05,由Turkey-Kramer HSD確定。

5 ? 耐寒和對寒冷敏感的RIL在應對寒冷脅迫時淀粉和糖含量的變化

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在土壤種植的植株（實驗2）中，暴露于CS24小時后，冷敏感RIL的淀粉含量高于冷耐受RIL（圖5A和B），而在對照植株（未暴露于冷環境）中，兩組的淀粉含量相似（補充數據圖S5A和B）。暴露于CS24小時后，冷敏感RIL的蔗糖水平顯著高于冷耐受RIL（圖5C）。相比之下，3個耐寒RIL（47、49和65）的葡萄糖含量顯著高于所有4個對冷敏感的RIL（5、71、90和150）（圖5D）。耐寒RIL的果糖含量普遍較高，但兩組之間的差異并不顯著（圖5E）。

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圖5.耐寒和敏感RIL暴露于冷脅迫期間淀粉和糖含量的變化。在1.5℃環境中生長24小時后，測量土壤中生長的植株（約30天大）葉片中的糖含量，包括冷敏感RIL（5、71、90、150）或冷耐受RIL（47、49、65、99）。（A和B）淀粉含量；（C）蔗糖含量；（D）葡萄糖含量；（E）果糖含量。數據為平均值±SE，n=4；生物重復。不同字母的橫杠表示敏感品系和耐受品系之間的顯著差異。單因素方差分析p≤0.05,由Turkey-Kramer HSD和T_檢驗確定（蔗糖）。

6 ? 果實和葉片對寒冷脅迫反應的基因表達模式相似

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耐寒RIL和對冷敏感RIL果實中差異表達（DEG）的幾個基因（如上所述），在兩個RIL組的葉片中對CS的反應表現出相似的表達模式。特別是有4個基因在耐寒RIL果實中的表達量高于對寒冷敏感的RIL，包括：Solyc05g013150（與賴氨酸甲基轉移酶同源）、Solyc05g013310（與受體激酶1 同源）、Solyc05g013330（與應激相關RNA 結合蛋白同源）和Solyc05g013320（與受體激酶2 同源），在暴露于CS 2小時（圖6AD）或24小時（圖6E-H）后，耐寒RIL葉片中的表達量也明顯高于冷敏感 RIL。同樣，4個在冷敏感RIL果實中的表達量高于冷耐受RIL的基因，包括Solyc11g071750（與鈣調蛋白樣37同源）、Solyc02g092450（與鈣轉運ATP酶同源）、Solyc01g099370（與鈣依賴性脂質結合同源）和Solyc10g050970（與乙烯反應因子D.4同源），在冷耐受RIL果實中的表達量也高于冷敏感RIL。在冷敏感RIL的葉片中也表現出較高的表達量（圖6I-L）。

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圖6.冷脅迫后耐寒或冷敏感RIL葉片中特定基因的表達。使用RT-qPCR測量了冷敏感RIL（5、71、90、150）和冷耐受RIL（47、49、65、99）葉片中的基因表達。土壤中生長的植株（齡約30天）在1.5℃的溫度下受到2或24小時的冷脅迫。數據為平均值±SE（n=3個生物重復）。不同字母的橫杠表示敏感品系和耐受品系之間的顯著差異。單因素方差分析p≤0.05,由Turkey-Kramer HSD確定。

討論

在本研究中，研究者利用了一個RIL群體（n=148），該群體先前由栽培番茄育種品系NCEBR-1與S.pimpinellifolium編號LA2093雜交培育而成，隨后利用超過144000個SNP標記進行了基因圖譜繪制。如上所述，該RIL群體標記基因型的可用性（NCBI檔案項目編號PRJNA449767）構成了一個重要優勢。最近對148個RIL的果實進行的冷藏篩選表明，該RIL群體在采后果實耐寒性方面存在顯著的表型差異。在篩選研究中，研究者確定了RIL群體中兩個對比度極高的群體（反應分布的兩端）：1）“耐寒”組，包括RIL-47、49、65和99；2）“寒冷敏感”組，包括RIL-5、71、90、135和150。在本研究中，研究者對這兩個RIL組進行了進一步研究，以探索在寒冷脅迫（CS）下所選RIL果實和葉片變異的分子和生物化學方面。此外，研究者還研究了果實采后貯藏期間的耐寒性與無性生長階段的耐寒性之間是否存在相關性。

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在比較兩個RIL組時，研究者對轉錄組數據進行了嚴格的生物信息分析篩選，這限制了鑒定的差異表達基因（DEG）的數量，但提高了確定DEG與CS反應之間可能聯系的可信度。在果實暴露于CS之前，只有7個基因被確定為兩個RIL組之間的DEGs（圖1A），其中大部分基因在番茄數據庫中沒有信息。對于這些基因，研究者利用擬南芥生物信息學數據庫尋找已知的或建議的功能最相似的蛋白質。在這7個DEGs中，有3個基因在冷敏感RIL中的轉錄水平較高，包括：1）Solyc05g054350，其氨基酸（AA）序列與擬南芥環氧化物水解酶（EH）具有顯著的同源性，EH酶參與多羥基角質單體的合成和自噬體的形成；2）Solyc05g053980，與抗病蛋白CCNBS-LRR家族存在有限的同源性，而CCNBS-LRR家族是植物抗病基因中最大的一類；在水稻中，發現了一種新型CC-NBS-LRR樣蛋白與鈣調素樣蛋白（CML）相互作用，并被認為共同參與了CS信號轉導和響應；3）Solyc02g082920，與一種酸性細胞外幾丁質酶高度同源；雖然幾丁質酶主要因參與病原體反應而為人所知，但這些酶也參與非生物（包括冷）脅迫反應。在7個暴露于CS前的DEGs中，其余4個基因在耐寒RIL中的表達量較高。這些基因包括：1）Solyc05g013330，編碼與擬南芥脅迫相關RNA結合蛋白1（SRP1）同源的脅迫相關RNA結合蛋白，SRP1是一種C2C2-型鋅指蛋白，可結合RNA并在ABA響應中發揮作用；含鋅指的RNA結合蛋白先前已被證明參與植物耐寒過程；2）Solyc05g013150，編碼賴氨酸甲基轉移酶（LSMT），與擬南芥LSMT類蛋白相似，其主要可溶性生理底物是葉綠體1,6-二磷酸果糖醛縮酶（FBA）；FBA是光合作用中的一種關鍵酶，據報道與包括番茄在內的不同植物物種的CS反應和耐受性有關；3和4）Solyc05g013310和Solyc05g013320，被鑒定為受體激酶，在番茄基因組中串聯排列，其編碼蛋白與擬南芥HERK家族的受體樣蛋白激酶具有高度同源性；HERKs是各種信號轉導途徑中的主要傳感器，包括植物對干旱、鹽和冷脅迫的響應。后4個基因位于番茄5號染色體長臂的同一區域。盡管這些結果表明，該染色體區域與耐寒性之間可能存在聯系，但在同一基因組區域，耐寒和對寒冷敏感的RIL之間的其他基因并未受到不同的調控。在CS之前，耐寒RIL和對冷敏感RIL之間表達不同的基因可能參與了植物對非生物脅迫的預適應。

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在經受2小時CS處理的果實中，有10個基因在耐寒RIL和對冷敏感RIL之間受到顯著不同的調控（圖1B）。其中，4個基因在耐寒RIL中的表達量較高，其中3個基因在CS處理前在耐寒RIL中的表達量已經較高，包括編碼受體激酶的Solyc05g013310、編碼賴氨酸甲基轉移酶（LSMT）的Solyc05g013150和編碼RNA結合蛋白的Solyc05g013330；第4個基因（Solyc09g020190，編碼一種非特異性磷脂酶（SlNPC1））僅在暴露于CS后上調。值得注意的是，非特異性磷脂酶（NPC）被認為是磷脂信號網絡的關鍵組成部分，參與植物發育以及生物和非生物脅迫反應。其余6個DEGs在暴露于CS時在冷敏感RIL中表現出更高的表達量。其中包括：1）Solyc05g018050，與RING型E3泛素連接酶同源，它與非生物脅迫下植物存活率的提高有關；2）Solyc05g005460編碼核氧化還蛋白2（SlNRX2），以前曾被證明能負向調節植物的免疫力；在番茄中，SlNRX1（Solyc05g005470）被證明能通過增強抗氧化劑和熱休克基因的轉錄來正向調節熱脅迫耐受性；NRXs編碼核氧化還蛋白2（SlNRX2）；NRXs是一種氧化還原蛋白，含有3個串聯排列的硫代還原酶（TRX）樣模塊，定位于細胞核和細胞質中；這些蛋白是大多數真核生物體中潛在的核TRXs，被認為是細胞生理的氧化還原主調節因子和不同氧化還原敏感信號通路的樞紐；3）Solyc05g013450，與多藥和有毒化合物擠壓（MATE）轉運體解毒樣蛋白具有同源性；MATE轉運體具有從次級代謝物轉運到解毒、抗病和耐鋁等多種功能。在擬南芥中，MATE轉運體DTX33和DTX35發揮著對水分平衡調節至關重要的氯離子通道的功能。此前，MATE解毒樣基因的表達被證明受植物非生物脅迫的調控；4）Solyc03g044790，編碼甲基酯酶（methylesterase），即茉莉酸甲酯釋放酯酶；該酶之前被認為是植物中茉莉酸信號轉導的調控因子；例如，研究表明葡萄甲基酯酶1在低溫或紫外線-B處理下會顯著上調，并被認為在對這些脅迫的響應中發揮作用；5）Solyc09g059030，編碼葉綠體包膜醌氧化還原酶同源物（ceQORH）；例如，在擬南芥中，質體蛋白ceQORH是一種NADPH依賴性還原酶，其活性可減少長鏈、與脅迫相關的氧化脂質。6）Solyc09g018670，根據Prosite數據網站（https://prosite.expasy.org），編碼一個具有TLC（TRAM、LAG1和CLN8）脂質感應結構域的蛋白質；TLC結構域存在于一個膜相關蛋白家族中，據預測包含五個跨膜α螺旋；雖然TLC結構域的作用尚不清楚，但可能的功能包括參與脂質代謝、感應或運輸。在本研究中，耐寒RIL中LSMT編碼基因（Solyc05g013150）在冷脅迫處理前和處理后2小時都出現了上調。之前的一項研究發現，番茄果實暴露于5℃冷脅迫2小時后，LSMT被高度誘導，但只有在熱處理果實中，熱處理可減少冷損傷的發生；這一發現進一步證實LSMT可能參與了采后果實的耐寒性。

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耐寒RIL中高表達的基因可能參與了脅迫反應和耐受性。這些基因的連續高表達（不暴露于脅迫）可能會改善植物對冷脅迫的應對能力。冷敏感RIL在應對CS時高表達的基因可能會激活所需的生物過程，以抵消CS的負面影響，如有毒代謝物或ROS水平的升高。在暴露于CS24小時后，研究者在冷敏感組觀察到基因表達的顯著激活（圖1C），這可能反映了冷敏感果實對脅迫的耐受能力大大降低，導致生理和結構損傷增加，從而激活了各種保護途徑和相關基因。這種反應（即DEGs）可能是由鈣信號轉導和鈣離子結合蛋白介導的，在暴露于CS24小時后，冷敏感果實中的鈣信號轉導和鈣離子結合蛋白上調較多（圖1E）。此前有報道稱，鈣信號激活并調節了多種脅迫反應，包括對CS的反應。鈣離子轉運和信號機制在感知到CS后被激活，從而誘導植物細胞對脅迫做出反應。這些反應由特定的傳感器和多個轉錄因子的激活介導，導致下游基因的表達和植物的適當反應。在這種情況下，鈣調蛋白結合蛋白在暴露于CS24小時后的DEGs中占有很高的比例，它們在調節植物的CS反應中至關重要。

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在所有6個RIL（3個耐寒RIL和3個冷敏感RIL）中發現的被差異調控的大量基因（2454個，圖2）代表了番茄果實中的核心冷反應基因，這些基因可能參與了脅迫適應和保護機制。雖然耐寒和冷敏感RIL組之間存在特定的轉錄組差異，但由于其基因組具有顯著的相似性（平均50%的基因相同），因此預計不同RIL之間的冷反應轉錄組也具有相當大的相似性。在6個RIL中，果實中與光合作用相關的基因都受到了CS的負面影響，這表明葉綠體中負責結合葉綠素分子的蛋白質的合成和/或穩定性降低了。這些發現與之前的報道相吻合，即CS通過影響PSII活性對光合作用產生負面影響，而PSII對CS特別敏感。同樣，研究者觀察到CS改變了晝夜節律相關基因的表達，這與之前報道的這些基因參與細胞保護、能量代謝和信號通路的情況一致。研究者的發現支持晝夜節律時鐘重編程可能參與應激相關過程。總之，在研究者的調查中，當果實暴露于CS時觀察到的基因表達變化是其他研究之前報道的果實對CS的典型反應。

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在耐寒RIL和對冷敏感RIL的葉片中觀察到淀粉和糖代謝的差異（圖5）。耐寒RIL中淀粉和蔗糖含量較低可能與這些品系中葡萄糖和果糖含量較高有關。耐寒RIL的遺傳組成可能會對其淀粉代謝產生重大影響，這一點從觀察到的這些RIL的淀粉積累差異中可以看出（圖5）。這一觀察結果表明，耐寒RIL可能具有影響其淀粉和糖積累的獨特遺傳特征。在此之前，糖類被認為參與了對采后冷害的敏感性和響應，并且六糖和可溶性糖對CS的響應激增被認為有助于提高耐寒性。糖類被認為是相容性溶質，可以保護敏感的膜和蛋白質，增加細胞的張力壓力以保持細胞體積。它們還能起到清除ROS的作用。研究者的發現進一步支持了糖類參與CS耐受性。

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以前關于植物對CS反應的研究大多包括無性繁殖階段，但也有少數研究調查了生殖階段的CS反應。然而，很少有研究同時包括無性和生殖階段，也沒有研究這兩個階段對CS起作用的分子機制的異同。之前有幾項研究調查了番茄果實對CS的反應，發現了一些無性階段對CS反應的共同過程；然而，這些研究也發現了果實對CS反應的特殊過程，包括成熟相關和細胞壁降解相關的基因表達。本研究表明，在所研究的RILs中，果實的耐寒性與無性組織的耐寒性之間存在正相關。具體而言，果實耐寒性強的RIL在不同的無性系階段也表現出耐寒性，果實對寒冷敏感的RIL在無性系組織中也表現出對寒冷的敏感性（圖3和圖4）。分子分析進一步證實了果實和無性系組織對CS的反應存在正相關性；具體而言，在耐寒或對寒冷敏感的RIL的果實和葉片中觀察到了類似的差異基因表達模式（圖6）。這些觀察結果支持兩個階段對CS的生理和分子反應相似，并表明兩種組織類型應對CS的方式相似。

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在低溫條件下對水果和蔬菜進行采后貯藏可以延長農作物的貯藏時間，最大限度地減少農作物損失，提高農民收入。然而，作物在采后貯藏期間對寒冷的敏感性會導致生理損傷和隨后的病原體感染，從而在全球范圍內造成重大作物損失。雖然目前減輕收獲后貯藏期間寒害的方法已達到極限，但仍有機會通過遺傳手段提高植物的耐寒性，并開發出收獲后貯藏期間耐低溫能力更強的新作物栽培品種。本研究提供了番茄果實存在耐寒性的證據，并確定了與果實耐寒性相關的基因、生理和生化過程。這些發現可作為遺傳/生理/生化標記，用于培育具有更強采后耐寒性的新番茄近交系和雜交栽培品種。鑒定出的基因還可為開發具有采后貯藏期間耐寒性的轉基因番茄植株提供必要的信息。此外，發現類似基因可能有助于提高番茄苗期/植株早期和采后果實期的耐寒性，這表明有可能快速篩選植株早期的耐寒性，并培育出在采后果實貯藏期間具有更強耐寒性的種質。

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